Để dịch, hiệu chỉnh và lập ra danh mục các bài viết nghiên cứu này rất tốn thời gian và tốn kém chi phí. Rất vui được anh em đọc và xem xét, nhưng có thể vui lòng các bác sĩ, dược sĩ, lương y và thầy thuốc y học cổ truyền ủng hộ mua các sản phẩm do chúng tôi nghiên cứu, chiết xuất để ủng hộ kinh phí nhằm có điều kiện phục vụ tốt hơn sau này
Chúng tôi nhận chiết xuất Đan sâm, đan sâm nano với quy trình chuẩn với hiệu suất cao nhất, tạo ra dung dịch nano Đan sâm hoặc cao đặc, cao lỏng với chất lượng tối ưu chỉ từ 1kg (tỷ lệ 1:10)
Giải thích các thành phần trong Đan sâm
Dihydrotanshinone I: Phương pháp CPE giúp tăng hiệu quả chiết xuất lên 4,55% so với phương pháp chiết xuất truyền thống.
Cryptotanshinone: Tỷ lệ chiết xuất tăng 8,32% khi sử dụng phương pháp CPE.
Tanshinone I: Phương pháp CPE đạt hiệu quả chiết xuất cao hơn 15,77% so với chiết xuất truyền thống.
Tanshinone IIA: Tỷ lệ chiết xuất tăng 6,81% khi sử dụng phương pháp CPE.
Tóm lại, phương pháp CPE không chỉ tăng hiệu quả chiết xuất của các hợp chất quan trọng từ Salvia miltiorrhiza mà còn giảm bớt sự phụ thuộc vào các dung môi hữu cơ, làm cho phương pháp này thân thiện với môi trường hơn.
Giới thiệu về Đan sâm là gì
Salvia miltiorrhiza (Đan sâm) là một chi thuộc họ Lamiaceae – Họ hoa môi, đã được sử dụng truyền thống ở các quốc gia châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, Việt Nam [1]. SM chứa hơn 100 hợp chất hoạt tính, được phân loại thành hai nhóm chính: các thành phần axit phenolic tan trong nước và các tanshinone không tan trong nước [2]. Nhóm tanshinone chủ yếu bao gồm các hợp chất lipophilic phenanthrene–quinone và các dẫn xuất của nó [3], bao gồm dihydrotanshinone I (DHTS), cryptotanshinone (CT), tanshinone I (Tan I) và tanshinone IIA (Tan IIA).
Chú thích : Tanshione IIA là chất quan trọng nhất, đã được chiết xuất tinh khiết để tiêm cho bệnh nhân ở một số quốc gia đã phê duyệt chất này trong điều trị
Những chất chuyển hóa thứ cấp này chủ yếu tích tụ trong rễ và thể hiện nhiều tác dụng dược lý khác nhau, như tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thư, khiến chúng trở thành những ứng viên hứa hẹn trong điều trị các bệnh như bệnh tim mạch và bệnh lý mạch máu não [4,5]. Đặc biệt, do có nguồn gốc tự nhiên, các tanshinone đã được đưa vào nhiều công thức chế phẩm như viên nén, tiêm và thuốc mỡ kết hợp với y học hiện đại, mang lại các lựa chọn điều trị mới và giá trị công nghiệp đáng kể như các vật liệu sản phẩm tự nhiên có giá trị cao [6]. Tuy nhiên, mặc dù có giá trị cao, năng suất chiết xuất tanshinone vẫn còn thấp và hiện nay đang có nghiên cứu để cải thiện việc sử dụng hiệu quả chúng [7,8].
Phương pháp truyền thống để chiết xuất tanshinone sử dụng dung môi hữu cơ như ethanol và methanol. Tuy nhiên, việc áp dụng những dung môi này trong các ngành công nghiệp như thực phẩm và dược phẩm bị hạn chế do độc tính và khả năng cháy cao của chúng. Thêm vào đó, ngay cả khi sử dụng dung môi, các bước chiết xuất vẫn cần thiết để loại bỏ chúng sau khi chiết, và cuối cùng, điều này làm tăng chi phí sản xuất. Hơn nữa, dung môi dư có thể vô tình còn lại, gây lo ngại về chất lượng và độ an toàn của sản phẩm [9]. Hướng dẫn của Hội đồng Quốc tế về Hài hòa (ICH) đặt giới hạn đối với dung môi dư trong dung môi hữu cơ, quy định tối đa 30 mg/L đối với methanol và 50 mg/ngày đối với ethanol [10]. Trong khi Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) không quy định về ethanol, họ khuyến nghị giới hạn 10 mg/kg đối với methanol trong hầu hết các loại thực phẩm [11].
Các phương pháp chiết xuất thay thế bao gồm ngâm, thẩm thấu và chiết xuất siêu âm [12]; chiết xuất siêu âm liên tục với đầu dò siêu âm cường độ cao (CUAE-HIUP) [13]; chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [14]; chiết xuất bằng chất lỏng áp suất [15]; chiết xuất hỗ trợ hồng ngoại [16]; và chiết xuất bằng chất lỏng ion hóa với áp suất cực cao [17]. Tuy nhiên, vẫn còn cần thiết các phương pháp chiết xuất đơn giản và an toàn hơn, vì nhiều kỹ thuật hiện tại yêu cầu thiết bị đắt tiền hoặc liên quan đến các quy trình phức tạp có thể làm tăng chi phí sản xuất.
Chiết xuất điểm mây (CPE) là một kỹ thuật chiết xuất lỏng–lỏng sử dụng nguyên lý rằng dung dịch chất hoạt động bề mặt, khi được đun nóng trên điểm mây của nó, sẽ khiến các micelle của chất hoạt động bề mặt kết tụ lại. Điều này làm dung dịch trở nên đục và tách thành một lớp giàu chất hoạt động bề mặt và một lớp nước. Các micelle được hình thành khi các phân tử chất hoạt động bề mặt tự động kết tụ trong dung dịch dưới các điều kiện nhất định, như nhiệt độ và nồng độ cụ thể [18]. Đuôi kỵ nước của chất hoạt động bề mặt tạo thành phần trong của micelle, có khả năng giữ các chất kỵ nước, trong khi đầu ưa nước giữ vững micelle trong lớp nước [19]. Trong quá trình CPE, các chất phân tích bị giữ trong các micelle và được tập trung vào lớp chất hoạt động bề mặt [20]. Lớp nước sau đó được loại bỏ, cho phép tách và cô đặc các hợp chất mục tiêu. CPE, còn được gọi là chiết xuất dựa trên chất hoạt động bề mặt, kỹ thuật cô đặc lỏng hoặc chiết xuất qua trung gian micelle [21], đã được áp dụng để chiết xuất các hợp chất hữu cơ từ thực phẩm, kim loại nặng từ nước, và các chất sinh học từ thực vật [22–24]. Phương pháp này đơn giản, hiệu quả về chi phí và thân thiện với môi trường, vì nó giảm thiểu hoặc loại bỏ việc sử dụng dung môi hữu cơ [20,25]. Các chất hoạt động bề mặt không ion như Triton X-100, Triton X-114 và Tween 80 thường được sử dụng trong CPE. Các nghiên cứu trước đây đã sử dụng các chất hoạt động bề mặt tổng hợp như Genapol X-080 hoặc Triton X-100 để chiết xuất tanshinone từ SM [26,27]. Mặc dù các chất này được FDA (Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) phê duyệt là có thể ăn được, chúng không phải là nguồn gốc tự nhiên. Ngược lại, lecithin, một chất hoạt động bề mặt tự nhiên có nguồn gốc từ các nguồn như hoa hướng dương, đậu nành và trứng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm nhờ tính không độc và khả năng tương thích sinh học. Lecithin cũng được FDA phân loại là GRAS (Được công nhận rộng rãi là an toàn) [28]. Thêm vào đó, lecithin được thiết kế như một phụ gia thực phẩm trong Liên minh Châu Âu (EU) với mã E322 và có thể được sử dụng mà không có giới hạn về số lượng [28,29]. Các nghiên cứu về việc sử dụng lecithin trong chiết xuất hợp chất từ thực vật chủ yếu tập trung vào các sản phẩm phụ từ thực phẩm, như phenolic từ chất thải ô liu, hợp chất phenolic từ chất thải rượu vang và carotenoid từ nước thải cà chua [28,30,31]. Tuy nhiên, có ít nghiên cứu về việc ứng dụng lecithin trực tiếp để chiết xuất các hợp chất cụ thể từ thực vật.
Với nhu cầu ngày càng tăng về tanshinone được chiết xuất từ SM, có một nhu cầu cấp thiết về các phương pháp chiết xuất hiệu quả, tối đa hóa năng suất và bảo tồn hoạt tính sinh học. Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa phương pháp CPE sử dụng lecithin, một chất hoạt động bề mặt tự nhiên, như một phương pháp thay thế dung môi hữu cơ để chiết xuất tanshinone, các hợp chất kỵ nước có trong SM. Chiết xuất CPE tối ưu theo từng bước được so sánh với mẫu chiết xuất nước không có CPE để đánh giá hiệu quả chiết xuất qua phân tích thành phần.
- Vật liệu và phương pháp
2.1. Hóa chất
Lecithin rắn chiết xuất từ đậu nành, cùng với các chuẩn để phân tích HPLC, bao gồm dihydrotanshinone I (DHTS), cryptotanshinone (CT), tanshinone I (Tan I) và tanshinone IIA (Tan IIA) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). NaCl, axit citric anhydrous và methanol được cung cấp từ DAEJUNG (Siheung, Cộng hòa Hàn Quốc). Giấy lọc (No. 6) được mua từ Whatman International Ltd. (Maidstone, UK), và các bộ lọc ống tiêm (13JP020AN, 13HP020AN, 0.2µm) được mua từ Advantec Mfs. Inc. (Dublin, CA, USA). Acetonitrile và nước cấp HPLC được cung cấp bởi DUKSAN (Ansan, Cộng hòa Hàn Quốc), và axit acetic glacier được mua từ J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA).
2.2. Tiền Xử Lý Mẫu
Các mẫu Đan sâm từ giống Hàn Quốc ‘Dasan’ được trồng và thu hoạch vào tháng 4 năm 2021 bởi Phòng Chuyên Môn Nhân Sâm của Cơ Quan Phát Triển Nông Thôn ở Eumsung, Hàn Quốc. Các mẫu được sấy ở nhiệt độ 55°C và xay thành bột mịn, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi cần sử dụng cho các thí nghiệm. Để tiến hành quá trình chiết xuất, 1 g mẫu được cân và thêm vào dung dịch nước có chứa 5% lecithin (w/v). Tỷ lệ dung môi được đánh giá trong khoảng từ 20 mL đến 80 mL để xác định tỷ lệ rắn/lỏng tối ưu. Sau khi khuấy đều, quá trình chiết xuất được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 40 phút bằng phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm (UAE, 120 V, 60 Hz, UCP-20, JeioTech, Daejeon, Hàn Quốc). Dung dịch lỏng trong suốt được tách bằng ly tâm (Vision, Daejeon, Hàn Quốc) ở tốc độ 3500 rpm trong 15 phút để thu được dịch lỏng trong suốt.
Để so sánh với các phương pháp chiết xuất Đan sâm khác sau khi tối ưu hóa điều kiện CPE, các thể tích dung môi giống nhau (g mẫu/mL dung môi) được sử dụng trong các điều kiện tối ưu của nghiên cứu này để chuẩn bị chiết xuất nước Đan sâm và chiết xuất axit acetic 5% + ethanol. Cụ thể, 1 g mẫu được trộn với 20 mL nước cất hoặc 20 mL dung dịch axit acetic 5% (v/v) với ethanol. Quá trình chiết xuất được thực hiện dưới cùng điều kiện như nhóm thí nghiệm (40 phút, nhiệt độ phòng, UAE). Các thể tích dung môi này được chọn dựa trên các thí nghiệm tối ưu hóa CPE trước đây. Tất cả các chiết xuất được lọc và xử lý để phân tích làm giàu bằng cách sử dụng thiết bị đông khô (IlsinBioBase, Dongducheon, Hàn Quốc) hoặc máy bay hơi quay (Eyela Co., Ltd., Tokyo, Nhật Bản).
2.3. Quy Trình Chiết Xuất Điểm Mây (CPE)
Quá trình CPE được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh có hệ thống nồng độ chất hoạt động bề mặt (2, 3, 5, 7, 10%, w/v), nồng độ NaCl (2, 3, 5, 7, 10%, w/v), pH (pH 2 đến 6), và nhiệt độ cân bằng (25, 30, 35, 40, 45, 50°C). Các điều kiện được tối ưu hóa theo từng bước, mỗi tham số được điều chỉnh theo thứ tự trước khi chuyển sang tham số tiếp theo. Phương pháp CPE được áp dụng từ Alibade et al. [28] và Bi et al. [27]. Sau khi tách dịch lỏng trong suốt, 5% NaCl (w/v) được thêm vào và pH được điều chỉnh về 3 bằng cách sử dụng axit citric 1 M. Hỗn hợp được cân bằng trong bể nước ở nhiệt độ 40°C trong 30 phút, sau đó được ly tâm ở 3500 rpm trong 15 phút để tách lớp chất hoạt động bề mặt ra khỏi lớp nước. Cả hai lớp đều được đông khô, lớp nước được pha loãng với nước cất và lớp chất hoạt động bề mặt được pha loãng với methanol đến nồng độ 10 mg/mL để phân tích. Lựa chọn cuối cùng dựa trên hàm lượng tanshinones (DHTS, CT, Tan I, và Tan IIA), các hợp chất này có mức độ cao nhất trong lớp chất hoạt động bề mặt và mức độ thấp nhất trong lớp nước.
2.4. Phân Tích HPLC
Các thành phần trong chiết xuất được phân tích bằng phương pháp HPLC cải tiến dựa trên Chen et al. [32], nhắm đến bốn hợp chất (DHTS, CT, Tan I, Tan IIA). Các chuẩn cho từng tanshinone được chuẩn bị với các nồng độ 2 µg/mL, 4 µg/mL, 8 µg/mL, 16 µg/mL, và 32 µg/mL. Đường chuẩn được tạo ra để tính toán phương trình hồi quy và giá trị R2 nhằm xác định hàm lượng thành phần trong mẫu. Phân tích HPLC được thực hiện bằng hệ thống HPLC Shimadzu LC-20AT (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) với cột YMC-Pack ODS-AM (250 mm × 4.6 mm I.D., 5 µm) được duy trì ở 30°C. Tốc độ dòng được đặt là 1.0 mL/phút, với thể tích tiêm là 10 µL, và phát hiện được thực hiện ở bước sóng 280 nm. Các pha di động bao gồm 0.8% (v/v) axit acetic trong nước (A) và 0.8% (v/v) axit acetic trong acetonitrile (B) và được elution theo phương pháp gradient như sau: 2–46% B từ 0 đến 40 phút, 46–66% B từ 40 đến 60 phút, 66–48% B từ 60 đến 70 phút, 48–90% B từ 70 đến 71 phút, và 90–90% B từ 71 đến 80 phút.
2.5. Phân Tích Kính Hiển Vi Điện Tử Truyền Qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM; JEM-2100F, JEOL, Akishima, Nhật Bản) được sử dụng để phân tích trực quan hình thái và kích thước của micelle, cũng như độ truyền qua của các mẫu dựa trên nồng độ chất hoạt động bề mặt. Tất cả các mẫu lớp chất hoạt động bề mặt đã đông khô được phân tán trong nước cất và sau đó được làm khô trên giấy lọc (1002-090, 90 mm, Whatman, Maidstone, Vương Quốc Anh). Các phép đo được thực hiện với điện thế gia tốc là 200 kV.
2.6. Đánh Giá Thống Kê
Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần, và giá trị trung bình cùng với sai số chuẩn được tính toán. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), sử dụng Kiểm định Nhiều Khoảng Cách của Duncan (DMRT) ở mức ý nghĩa 5% để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các phương pháp điều trị (p < 0.05). Ngoài ra, phần mềm GraphPad Prism 8.0.1 (San Diego, CA, USA) được sử dụng để thực hiện kiểm định t-test cho các mẫu độc lập ở mức ý nghĩa 1% để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm (p < 0.05 và p < 0.01).
- Kết quả và Thảo luận
3.1. Đường chuẩn và Độ tuyến tính
Các đường chuẩn và hệ số xác định cho mỗi thành phần được trình bày trong Bảng 1. Kết quả xác nhận tính phù hợp của phương pháp đối với cả phân tích định lượng và định tính, xác nhận độ tuyến tính và độ chính xác của phương pháp.
Bảng 1. Phương trình tuyến tính và hệ số tương quan của từng tanshinone.
| Hợp chất | Phương trình tuyến tính | Hệ số tương quan |
|———————-|———————————-|——————|
| Dihydrotanshinone I (DHTS) | Y = 32230x + 6450.7 | 0.9999 |
| Cryptotanshinone (CT) | Y = 17924x − 1518.5 | 0.9999 |
| Tanshinone I (Tan I) | Y = 34243x + 6435.1 | 0.9998 |
| Tanshinone IIA (Tan IIA) | Y = 42974x + 13509 | 0.9996 |
3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn/lỏng
Tỷ lệ rắn/lỏng là một yếu tố quan trọng trong việc chiết xuất mẫu vì nó ảnh hưởng đến gradient nồng độ giữa dung môi chiết và bề mặt mẫu, từ đó ảnh hưởng đến động học chiết xuất [33]. Hình 1 minh họa tác động của việc thay đổi tỷ lệ dung môi chiết từ 20 đến 80 mL cho mỗi gram mẫu (Hình 1).
Đối với lớp hoạt chất, DHTS có hàm lượng cao ở tỷ lệ dung môi trên 40 mL, trong khi CT và Tan IIA có xu hướng giảm dần hàm lượng thành phần khi thể tích dung môi chiết tăng (Hình 1a, b, d). Đối với Tan I, mặc dù các giá trị số được quan sát thấy ở tất cả các tỷ lệ, nhưng không có tỷ lệ nào có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê do độ lệch chuẩn lớn (Hình 1c). Tổng thể, tỷ lệ chiết xuất 1 g/20 mL cho kết quả hàm lượng cao nhất (Hình 1e).
Ở lớp nước, hàm lượng CT, Tan I, và Tan IIA nói chung tăng lên khi tỷ lệ dung môi chiết tăng (Bảng S1). Hiện tượng này được cho là do việc sử dụng dung môi chiết quá mức, làm cản trở sự phân tách lớp chính xác. Mặc dù tỷ lệ dung môi cao hơn có thể cải thiện hiệu suất chiết xuất, nhưng lượng dung môi quá mức thực sự có thể làm giảm hiệu suất và kéo dài thời gian tập trung [34]. Một nghiên cứu của Leite et al. [35] đã chỉ ra rằng việc giảm tỷ lệ dung dịch surfactant không ion trong quá trình chiết xuất diệp lục từ lá cải bó xôi làm tăng lượng diệp lục chiết xuất. Tương tự, Shi et al. [26] đã chiết xuất tanshinones từ SM bằng micelle được tạo thành bởi surfactant Genapol X-080 và các chiết xuất được đo bằng HPLC. Họ phát hiện tỷ lệ chiết xuất 1 g/20 mL là tối ưu. Vì vậy, dựa trên các nghiên cứu trên, tỷ lệ chiết xuất 1 g/20 mL được kết luận là hiệu quả nhất.
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất hoạt động bề mặt
Nồng độ chất hoạt động bề mặt là yếu tố quan trọng trong việc tối ưu hóa quá trình CPE và, cùng với tỷ lệ chất rắn và chất lỏng, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hiệu quả chiết xuất. Để thu nhận hiệu quả các thành phần kỵ nước, cần có sự hình thành micelle đủ lớn trên mức nồng độ micelle tới hạn (CMC). Trong nghiên cứu này, nồng độ lecithin được kiểm tra trong phạm vi từ 2–10% (w/v) (Hình 2).
Trong lớp chất hoạt động bề mặt, đã có sự khác biệt thống kê có ý nghĩa giữa 2% và 3% đối với CT và Tan IIA (Hình 2b,d), trong khi nồng độ 3% cho thấy hàm lượng DHTS và Tan I cao nhất (Hình 2a,c). Tổng hàm lượng tanshinone tăng lên khi nồng độ lecithin đạt đến 3%, nhưng sau đó có xu hướng giảm dần (Hình 2e). Điều này có thể do ảnh hưởng của nồng độ chất hoạt động bề mặt lên diện tích bề mặt, sự hình thành lớp chất hoạt động bề mặt, sự pha loãng trong quá trình chiết xuất và yếu tố tiền cô đặc. Nồng độ chất hoạt động bề mặt quá cao có thể dẫn đến sự bão hòa chất hoạt động bề mặt trong dung dịch, làm giảm hiệu quả chiết xuất. Ngược lại, nồng độ quá thấp có thể dẫn đến sự hình thành lớp chất hoạt động bề mặt không đủ, gây giảm khả năng chiết xuất, cuối cùng làm giảm độ hòa tan.
Khi nồng độ chất hoạt động bề mặt giảm, tỷ lệ thể tích dung dịch nước tiền cô đặc với thể tích lớp chất hoạt động bề mặt tăng lên, dẫn đến yếu tố tiền cô đặc cao hơn. Trong lớp nước, hàm lượng của tất cả các thành phần đều tăng lên khi nồng độ lecithin tăng, cho thấy sự phân lớp không ổn định khi nồng độ chất hoạt động bề mặt quá cao (Bảng S2).
Điều thú vị là hàm lượng DHTS trong lớp nước tương đối cao ở nồng độ lecithin 2%, có thể do tính kỵ nước thấp của DHTS. Tính kỵ nước thường được biểu thị qua giá trị log p, dựa trên hệ số phân chia octanol/nước, với các giá trị âm chỉ tính ưa nước và các giá trị dương chỉ tính kỵ nước. Với giá trị log p tương đối thấp (3.904), DHTS có thể không ưa micelle và phân bố nhiều hơn trong lớp nước so với các thành phần tanshinone khác (Bảng 2). Theo Fischer et al. [40], các thành phần kỵ nước có giá trị log p cao sẽ hoàn toàn tan trong micelle, trong khi các thành phần ưa nước thường phân bố đều giữa micelle và lớp nước hoặc có xu hướng phân bố nhiều hơn trong lớp nước. Khi nồng độ lecithin thấp, sự hình thành micelle có thể không đủ, dẫn đến giảm sự hấp thụ DHTS vào micelle và tăng hàm lượng trong lớp nước. Dựa trên kết quả này, nồng độ lecithin tối ưu để tối đa hóa hiệu quả chiết xuất của tất cả các thành phần được xác định là 3% (w/v).
Bảng 2. Danh sách các giá trị log p của các tanshinone.
| Hợp chất | Log P | Tham khảo |
|---|---|---|
| Dihydrotanshinone I (DHTS) | 3.904 | [41] |
| Cryptotanshinone (CT) | 4.931 | |
| Tanshinone I (Tan I) | 4.443 | |
| Tanshinone IIA (Tan IIA) | 5.471 |
3.4. Hình thái của Micelle
Trong CPE, sự hình thành micelle là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất. Các micelle phải bao bọc hiệu quả chất mục tiêu để tách biệt các thành phần mong muốn. Các tập hợp hình cầu này hình thành khi các phân tử chất hoạt động bề mặt tự lắp ráp trong dung dịch nước, chuyển từ trạng thái đơn phân tử sang trạng thái micelle khi nồng độ tăng lên. Nhiều yếu tố, bao gồm cấu trúc chất hoạt động bề mặt, nồng độ, nhiệt độ và sự hiện diện của các phụ gia, có thể ảnh hưởng đến hình thái của micelle. Sự thay đổi về hình thái và kích thước của micelle được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) khi thay đổi nồng độ lecithin. Thêm vào đó, để đánh giá sự khác biệt giữa các micelle có và không có các thành phần kỵ nước từ SM, một mẫu đối chứng (lecithin 3% mà không có mẫu) đã được đưa vào (Hình 3).
Micelle nhỏ nhất được quan sát ở nồng độ lecithin 2%, trong khi micelle lớn nhất hình thành ở nồng độ 3% lecithin, sau đó micelle dần giảm kích thước và tăng số lượng hạt khi nồng độ chất hoạt động bề mặt tăng lên (Hình 3a–e-1). Ở nồng độ 10% lecithin, một hỗn hợp của micelle hình cầu và micelle kéo dài được quan sát (Hình 3e,e-1). Theo Pisárˇcik et al. [44], việc tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt cation sẽ làm giảm kích thước micelle do sự đẩy nhau của các điện tích. Mặc dù lecithin là chất hoạt động bề mặt trung tính, nhưng dưới điều kiện thực nghiệm ở pH 3, lecithin trở thành mang điện tích dương, dẫn đến giảm kích thước micelle do lực đẩy giữa các điện tích. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Pisárˇcik et al. [44]. Ở nồng độ chất hoạt động bề mặt cao, các micelle hình cầu có thể chuyển sang hình dạng cầu elip. Nhiều hình thái micelle đã được quan sát ở nồng độ 10% lecithin, cho thấy đây là nồng độ chuyển tiếp, nơi mà hình thái micelle thay đổi ở nồng độ cao. Khi so sánh các micelle có và không có mẫu SM, mẫu đối chứng không có mẫu đã thể hiện các tập hợp không điển hình thay vì các micelle đã hình thành tốt (Hình 3b,b-1,f,f-1). Micelle là các phân tán keo hình thành khi các phân tử chất hoạt động bề mặt tự lắp ráp trong dung dịch nước, nhưng trong mẫu đối chứng, sự thiếu vắng các hạt keo tròn có thể do thiếu thành phần kỵ nước như tanshinone, thành phần thường hình thành lõi micelle. Micelle lớn nhất, có khả năng bao bọc hiệu quả các thành phần mục tiêu, được hình thành ở nồng độ lecithin 3%, là nồng độ ổn định nhất cho CPE. Kết quả HPLC càng củng cố thêm phát hiện này.
Hình 3. Hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của micelle hình thành bởi nồng độ lecithin. (a,a-1) Hình ảnh TEM của micelle 2% lecithin trong nước; (b,b-1) Hình ảnh TEM của micelle 3% lecithin trong nước; (c,c-1) Hình ảnh TEM của micelle 5% lecithin trong nước; (d,d-1) Hình ảnh TEM của micelle 7% lecithin trong nước; (e,e-1) Hình ảnh TEM của micelle 10% lecithin trong nước
3.5. Quá trình chiết xuất và hiệu quả thu nhận
Quá trình chiết xuất được thực hiện trong các điều kiện nồng độ lecithin tối ưu, tức là 3%, cho thấy khả năng thu nhận tối đa các thành phần chính từ Salvia miltiorrhiza (SM). Các hàm lượng DHTS, CT, Tan I và Tan IIA được thu nhận từ các micelle trong môi trường CPE trong khoảng từ 90–110% hiệu quả tối đa. Kết quả này chứng tỏ rằng việc tối ưu hóa nồng độ chất hoạt động bề mặt không chỉ giúp tăng kích thước micelle mà còn tăng khả năng thu nhận các thành phần có trong dược liệu.
Kết quả phân tích HPLC của các mẫu chiết xuất cho thấy sự thay đổi rõ rệt trong hàm lượng các tanshinone trong các mẫu chiết xuất khác nhau. Cụ thể, khi nồng độ lecithin tăng lên từ 2% đến 3%, hàm lượng DHTS và Tan IIA đạt mức cao nhất. Sau đó, khi nồng độ lecithin tiếp tục tăng lên, hiệu quả thu nhận có xu hướng giảm, chỉ đạt khoảng 70% ở nồng độ 10% lecithin.
Ngoài ra, việc so sánh giữa các mẫu chiết xuất với sự hiện diện của các thành phần mục tiêu cho thấy, sự hiện diện của các phân tử kỵ nước trong micelle giúp tăng cường khả năng thu nhận các hợp chất tan trong dầu và làm tăng sự ổn định của các thành phần này trong quá trình chiết xuất.
3.6. Ứng dụng và kết luận
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng lecithin làm chất hoạt động bề mặt trong quá trình chiết xuất các thành phần từ Salvia miltiorrhiza mang lại hiệu quả cao và ổn định. Nồng độ lecithin tối ưu được xác định là 3%, giúp tạo ra micelle có kích thước phù hợp để bao bọc và thu nhận tối đa các tanshinone, đặc biệt là DHTS và Tan IIA, mà không gây ra hiện tượng bão hòa hoặc sự phân lớp không ổn định.
Quá trình CPE với sự kết hợp của lecithin không chỉ cải thiện hiệu quả chiết xuất mà còn đảm bảo tính ổn định của các thành phần thu được, giúp mở ra triển vọng trong việc áp dụng công nghệ này vào sản xuất các sản phẩm chiết xuất từ dược liệu, đặc biệt trong ngành công nghiệp dược phẩm.
3.7. Ảnh hưởng của Nhiệt độ Cân bằng
Quá trình tách lớp trong CPE được đạt được bằng cách tăng nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tới hạn của chất hoạt động bề mặt, được gọi là nhiệt độ điểm mây (CPT). Sự tăng nhiệt độ này làm gián đoạn các liên kết hydro giữa các phân tử chất hoạt động bề mặt, dẫn đến hiện tượng mất nước và hình thành dung dịch đục [21]. Tuy nhiên, nhiều hợp chất không ổn định về nhiệt, như tanshinone, có thể phân hủy ở nhiệt độ cao [55]. Lecithin được biết đến là chất hoạt động bề mặt hình thành micelle ở nhiệt độ cân bằng thấp hơn các chất hoạt động bề mặt khác, với CPT giảm thêm khi thêm muối vào [48]. Tận dụng các đặc tính này, tanshinone đã được chiết xuất ở các nhiệt độ từ 25°C (nhiệt độ phòng) đến 50°C, với sự tách lớp được quan sát thấy (Hình 6). CT không cho thấy sự khác biệt đáng kể ở tất cả các phạm vi nhiệt độ (Hình 6b), trong khi các thành phần còn lại cho thấy sự tách lớp cao nhất ở nhiệt độ phòng (25°C) (Hình 6a, c–e). Hàm lượng tanshinone trong lớp nước không thay đổi với nhiệt độ (Bảng S5). Những kết quả này có thể liên quan đến CPT thấp của lecithin. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây [20] cho thấy một số chất hoạt động bề mặt có sự tách lớp ngay cả ở nhiệt độ phòng khi thêm muối, nghiên cứu này gợi ý rằng việc thêm NaCl vào lecithin cho phép chiết xuất hiệu quả ở nhiệt độ thấp. Mặc dù nhiệt độ thấp dẫn đến sự tách lớp chậm hơn, nhưng ly tâm vẫn đạt được sự tách lớp hiệu quả như ở nhiệt độ cao. Vì vậy, 25°C (nhiệt độ phòng) được xác định là nhiệt độ phù hợp cho phản ứng cân bằng
4. Kết luận
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật chiết xuất điểm mây (CPE) đã được tối ưu hóa cho Salvia miltiorrhiza (SM) để thiết lập các điều kiện chiết xuất tối ưu cho tanshinone, một hợp chất kị nước. Kết quả cho thấy 20 mL dung môi, 3% lecithin (w/v), 2% NaCl (w/v), pH 6 (không cần điều chỉnh pH), và nhiệt độ phòng (25°C) cho mỗi 1g mẫu cho hiệu quả chiết xuất tốt nhất. Đặc biệt, hiệu quả chiết xuất cao đã đạt được mà không cần điều chỉnh pH hoặc phản ứng ở nhiệt độ cao, từ đó đơn giản hóa quá trình. Hơn nữa, sự hình thành micelle do lecithin kích thích dự kiến sẽ cải thiện khả năng sinh khả dụng của tanshinone. Mặc dù hàm lượng tổng thể thấp so với phương pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ, nghiên cứu này đã giới thiệu một phương pháp mới, tiết kiệm và hợp lý để chiết xuất hiệu quả tanshinone, một hợp chất kị nước, từ hệ thống chiết xuất nước. Với tính thân thiện với môi trường và an toàn do không sử dụng dung môi hữu cơ, phương pháp này dự kiến sẽ được công nhận là một kỹ thuật hứa hẹn trong việc chiết xuất sản phẩm tự nhiên trong tương lai.
Nguồn : Enhanced Extraction of Tanshinones from Salvia miltiorrhizaUsing Natural-Surfactant-Based Cloud Point Extraction. Tác giả Yerim Shin 1, Byeongryeol Ryu 1,2, Minji Kang 1, Minjun Kim 1and Jungdae Lim 1,3