Tóm tắt (Abstract)
Sự thay đổi về hàm lượng phenol, polysaccharide và thành phần hợp chất bay hơi của nước ép nhàu (Morinda citrifolia L.) được phân tích trong quá trình lên men kéo dài 63 ngày ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy.
Hàm lượng phenol, polysaccharide và đặc tính mùi hương thay đổi rõ rệt tùy theo quy mô và thời gian lên men.
Hàm lượng flavonoid trong nước ép nhàu tăng dần theo quá trình lên men.
Tổng cộng có 73 hợp chất bay hơi được xác định bằng phương pháp chiết vi pha rắn kết hợp sắc ký khí – khối phổ (SPME-GC-MS).
Các hợp chất như methyl hexanoate, 3-methyl-3-buten-1-ol, acid octanoic, acid hexanoic và 2-heptanone được xác định là thành phần mùi chính của nước ép nhàu tươi và lên men.
Sự giảm hàm lượng acid octanoic và acid hexanoic làm cho mùi của nước ép nhàu ở quy mô nhà máy trở nên ít hăng hơn.
Kết quả phân tích thành phần chính (PCA) từ hệ thống “mũi điện tử” cho thấy sự khác biệt về oxit nitơ, alkane, alcohol, hợp chất thơm và hợp chất chứa lưu huỳnh góp phần phân biệt nước ép nhàu theo thời gian và quy mô lên men.
https://www.mdpi.com/1420-3049/26/9/2604
1. Giới thiệu (Introduction)
Nhàu (Morinda citrifolia L.) là một loài thực vật phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới [1,2].
Rễ, thân, lá, quả và hạt của cây nhàu đã được sử dụng trong y học cổ truyền hơn một nghìn năm để điều trị các bệnh như tiểu đường, đau đầu và viêm khớp [3,4].
Là phần có thể ăn được của cây, quả nhàu chứa polysaccharide, polyphenol và các hoạt chất sinh học khác [5–8].
Các nghiên cứu dược lý cho thấy quả nhàu có tác dụng điều trị viêm, tiêu chảy, tăng huyết áp và hạ đường huyết [9–11].
Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng quả nhàu có nhiều hoạt tính sinh học [1], nhưng mùi vị khó chịu của nó khiến không phù hợp để sử dụng tươi.
Sau khi lên men, nước ép nhàu giảm bớt mùi khó chịu. Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của nước ép nhàu được ghi nhận là tăng đáng kể sau khi lên men [12].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nước ép nhàu lên men có thể:
- Cải thiện tổn thương gan cấp do rượu [13]
- Điều hòa đáp ứng miễn dịch [14]
Trong các nghiên cứu trước, khoảng 80 hợp chất bay hơi đã được phát hiện trong quả nhàu tươi, bao gồm:
- este acid béo
- monoterpen
- acid
- alcohol
- aldehyde
Trong đó, acid octanoic và acid hexanoic là các hợp chất chiếm ưu thế [8,15].
Các acid như octanoic, hexanoic và butanoic – vốn liên quan đến mùi phô mai, mồ hôi nặng và mùi hăng khó chịu [16] – được xem là nguyên nhân chính gây ra mùi khó chịu của nước ép nhàu [17].
Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại nước ép nhàu được sản xuất với các thời gian lên men khác nhau, có thể chia thành:
- lên men ngắn hạn
- lên men khoảng 1 tháng
- lên men dài hạn [18]
Tuy nhiên, đặc điểm hương vị của nước ép nhàu theo các thời gian lên men khác nhau vẫn chưa được làm rõ.
Ngoài ra, do đây là quá trình lên men tự nhiên, quy mô lên men cũng có thể ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất và hương vị của sản phẩm [19].
Đặc điểm mùi vị của nhàu lên men có thể khác nhau giữa quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp.
Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát sự thay đổi của:
- các hợp chất bay hơi
- phenol
- polysaccharide
trong nước ép nhàu được sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp.
Kết quả nghiên cứu có thể cung cấp cơ sở khoa học để cải tiến quy trình sản xuất nước ép nhàu lên men.
2. Kết quả và thảo luận
2.1. Sự thay đổi của polyphenol, flavonoid và polysaccharide trong quá trình lên men
Hàm lượng polyphenol tổng số trong nước ép nhàu theo các thời điểm lên men khác nhau được trình bày trong Hình 1a.
Ở nước ép tươi (ngày 0, F0), hàm lượng polyphenol tổng số là 168.35 ± 3.54 mg GAE/100 mL.
Trong suốt quá trình lên men 63 ngày, hàm lượng polyphenol tổng số ban đầu giảm, sau đó tăng lên, rồi lại giảm tiếp.
Hàm lượng polyphenol đạt mức thấp nhất tại thời điểm L56 và F21, lần lượt là:
- 125.93 ± 12.02 mg GAE/100 mL
- 156.02 ± 6.20 mg GAE/100 mL
Hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất đạt được tại:
- L28: 199.77 ± 8.12 mg GAE/100 mL
- F28: 185.60 ± 5.20 mg GAE/100 mL
Hàm lượng polyphenol có sự biến động rõ rệt trong cả quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy.
Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng polyphenol giữa hai quy mô lên men tại các thời điểm ngày 7, 14, 21, 35, 49, 56 và 63.
Hình 1. Sự thay đổi hàm lượng phenol tổng số (a), flavonoid (b) và polysaccharide (c) trong quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy. Các chữ cái khác nhau trên cùng một đường biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05. Dấu * biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai quy mô tại cùng thời điểm lên men.
Như thể hiện ở Hình 1b, hàm lượng flavonoid có xu hướng tăng trong suốt quá trình lên men 63 ngày ở cả hai quy mô phòng thí nghiệm và nhà máy.
So với nước ép đã lên men, hàm lượng flavonoid của nước ép nhàu tươi là thấp nhất, đạt 26.07 ± 0.54 mg RE/100 mL.
Hàm lượng flavonoid đạt giá trị cao nhất là 36.73 ± 2.51 mg RE/100 mL vào ngày thứ 63 trong quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm.
Ở quy mô nhà máy, hàm lượng flavonoid cao nhất là 43.28 ± 1.66 mg RE/100 mL vào ngày thứ 49, sau đó giảm xuống.
Trong suốt quá trình lên men, hàm lượng flavonoid ở quy mô nhà máy thường cao hơn so với quy mô phòng thí nghiệm.
Sau 35 ngày lên men, có sự khác biệt có ý nghĩa về hàm lượng flavonoid giữa hai quy mô lên men.
Trong quá trình lên men nước ép, chủng loại và số lượng vi sinh vật góp phần vào chất lượng cảm quan và sự chuyển hóa các thành phần hoạt tính sinh học.
Vi sinh vật chuyển hóa thực phẩm và biến đổi polyphenol thông qua các hệ enzyme phức tạp trong quá trình lên men.
Các nghiên cứu trước cho thấy hàm lượng acid hydroxycinnamic và anthocyanin giảm, trong khi tổng flavanol tăng trong quá trình lên men nước ép nho đen.
Tổng hàm lượng flavonoid cũng được ghi nhận tăng trong quá trình lên men nước ép Dendrobium officinale và chuối bởi vi khuẩn lactic.
Sự thay đổi hàm lượng polyphenol và flavonoid có thể do các polyphenol phức tạp bị enzyme phân giải thành các flavanol đơn giản hơn trong quá trình lên men.
Kết quả này phù hợp với các quan sát trước đó, khi ghi nhận sự tăng flavanol và giảm tổng polyphenol trong quá trình lên men bằng nấm men.
Như thể hiện ở Hình 1c, hàm lượng polysaccharide trong nước ép nhàu tươi (ngày 0) là 6.45 ± 0.71 mg/mL.
Hàm lượng polysaccharide có xu hướng giảm trong 42 ngày đầu lên men và đạt mức thấp nhất là 2.11 ± 0.71 mg/mL vào ngày 42, sau đó tăng lên mức cao 6.28 ± 2.48 mg/mL vào ngày 56 trong quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm.
Trong quá trình lên men ở quy mô nhà máy, hàm lượng polysaccharide ban đầu tăng, sau đó giảm.
Hàm lượng polysaccharide đạt giá trị cao nhất là 8.66 ± 0.30 mg/mL vào ngày thứ 7 và giảm xuống mức tương đối thấp từ ngày 42 đến 63, trong khoảng 4.61 ± 0.96 mg/mL đến 3.57 ± 1.10 mg/mL.
Polysaccharide được xem là một trong những thành phần hoạt tính sinh học chính của nước ép nhàu lên men.
Các enzyme thủy phân do vi sinh vật tạo ra có thể phân giải thành tế bào thực vật không tan thành polysaccharide hòa tan và tiếp tục phân cắt polysaccharide thành oligosaccharide hoặc monosaccharide, dẫn đến sự tăng hoặc giảm nồng độ polysaccharide trong quá trình lên men.
Hàm lượng polysaccharide được ghi nhận tăng trong quá trình lên men nước ép cà rốt bởi Lactobacillus gasseri, do vi sinh vật này tổng hợp enzyme fructosyltransferase giúp chuyển hóa đường đơn thành polysaccharide.
Trong khi đó, Lactobacillus plantarum lại làm giảm hàm lượng polysaccharide trong quá trình lên men một số loại nước ép trái cây.
Ảnh hưởng của các vi sinh vật khác nhau đến việc giải phóng polysaccharide từ thành tế bào cho thấy sự khác biệt rõ rệt ngay cả trong cùng điều kiện lên men.
Các vi sinh vật chiếm ưu thế bị ảnh hưởng bởi điều kiện lên men, từ đó dẫn đến thay đổi hệ enzyme và quá trình chuyển hóa chất nền.
Các nghiên cứu trước đã ghi nhận sự khác biệt đáng kể về mùi, màu sắc và độ đục giữa quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy.
Trong nghiên cứu này, sự khác biệt về quy mô lên men có thể đã gây ra thay đổi về mật độ lên men và nhiệt độ, dẫn đến sự khác biệt giữa hai quy mô.
Ngoài ra, các kết quả chưa công bố cho thấy hệ vi sinh trong nước ép nhàu lên men có sự khác biệt đáng kể giữa quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy.
Tóm lại, kết quả cho thấy hàm lượng phenol, flavonoid và polysaccharide có sự khác biệt rõ rệt giữa hai quy mô lên men, có thể do sự khác biệt về hệ vi sinh gây ra bởi quy mô lên men khác nhau.
3. Nguyên liệu và phương pháp
3.1. Nguyên liệu và hóa chất
Quả nhàu (giống “Kuke”) được cung cấp bởi cơ sở công nghiệp nhàu Vạn Ninh, Hải Nam (Trung Quốc) vào tháng 3 năm 2017.
Acid gallic (độ tinh khiết 98%) và rutin (độ tinh khiết 97%) được mua từ Alfa Aesar (Mỹ).
Phenol và thuốc thử Folin–Ciocalteu được mua từ Công ty Công nghệ Solarbio (Bắc Kinh, Trung Quốc).
Acid 3,5-dinitrosalicylic (độ tinh khiết 98%) được mua từ Công ty Hóa chất Sinopharm (Thượng Hải, Trung Quốc).
Tất cả các hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết phân tích.
3.2. Lên men quả nhàu
3.2.1. Lên men quy mô nhà máy
Quá trình lên men được thực hiện theo quy trình của nhà máy.
Các quả nhàu có cùng độ chín được lựa chọn và rửa bằng nước chảy.
Sau đó, quả được ngâm trong dung dịch chlorine dioxide 60 mg/L trong 30 phút, rồi rửa lại bằng nước vô trùng.
Sau khi để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, quả nhàu được đưa vào thiết bị lên men dung tích 10 tấn để lên men ở nhiệt độ phòng.
Dịch lên men được thu thập từ bồn lên men vào các ngày 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 và 63, sau đó được bảo quản ở −80 °C.
3.2.2. Lên men quy mô phòng thí nghiệm
Quả nhàu cùng lô với mẫu dùng trong nhà máy được lên men trong phòng thí nghiệm theo quy trình tương tự.
Cụ thể, quả nhàu được rửa bằng nước chảy, sau đó ngâm trong dung dịch chlorine dioxide 60 mg/L trong 30 phút.
Sau khi rửa lại bằng nước vô trùng, quả được cho vào thiết bị lên men vô trùng dung tích 6 L và lên men ở nhiệt độ phòng.
Dịch lên men được thu thập vào các ngày 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 và 63, sau đó được bảo quản ở −80 °C.
3.3. Xác định polyphenol và flavonoid
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp Folin–Ciocalteu.
Cụ thể, lấy 0,625 mL mẫu nước ép, pha loãng 50 lần bằng nước tinh khiết, sau đó cho vào ống nghiệm.
Thêm 0,125 mL thuốc thử Folin–Ciocalteu vào dung dịch.
Sau 6 phút, thêm 1,25 mL dung dịch Na₂CO₃ 7,0% và 1 mL nước tinh khiết, để phản ứng trong tối 90 phút.
Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 760 nm bằng máy quang phổ.
Hàm lượng polyphenol được tính dựa trên đường chuẩn acid gallic và biểu thị bằng mg GAE/100 mL nước ép nhàu.
Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định theo phương pháp tạo màu với NaNO₂ và AlCl₃.
Cụ thể, trộn 0,3 mL mẫu với 1,5 mL nước tinh khiết và 90 μL dung dịch NaNO₂ 5,0%.
Sau 6 phút, thêm 180 μL dung dịch AlCl₃ 10,0% và để yên 5 phút.
Tiếp theo, thêm 0,6 mL NaOH 1 M và bổ sung nước tinh khiết đến thể tích 3 mL.
Đo độ hấp thụ tại bước sóng 510 nm bằng máy đọc vi tấm.
Kết quả được tính theo đường chuẩn rutin và biểu thị bằng mg RE/100 mL nước ép nhàu.
3.4. Xác định polysaccharide
Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol–acid sulfuric.
Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp đo màu DNS.
Hàm lượng polysaccharide được tính bằng hiệu số giữa đường tổng và đường khử.
3.5. Phân tích GC-MS
Phân tích SPME-GC-MS được thực hiện với một số điều chỉnh phù hợp.
Mẫu được khuấy ở tốc độ 1400 vòng/phút trong 3 phút.
Trộn 5 mL mẫu với 4 mL dung dịch NaCl bão hòa trong bình kín, sau đó ủ ở 40 °C trong 30 phút.
Sợi SPME được đưa vào phần không gian hơi phía trên mẫu trong 10 phút để hấp phụ các hợp chất bay hơi.
Sau đó, sợi được đưa vào buồng tiêm của máy GC và giải hấp nhanh ở 240 °C trong 3 phút.
Phân tích GC-MS được thực hiện với cột mao quản silica DB-Wax.
Chương trình nhiệt bắt đầu từ 40 °C trong 10 phút, sau đó tăng 8 °C/phút đến 240 °C.
Khí mang là nitơ tinh khiết với lưu lượng 1 mL/phút.
Phổ khối được ghi ở chế độ ion hóa va chạm điện tử với năng lượng 70 eV.
Các hợp chất được nhận diện bằng thư viện NIST và hàm lượng tương đối được tính theo diện tích peak.
3.6. Phân tích mũi điện tử
Thiết bị mũi điện tử gồm 10 cảm biến bán dẫn oxit kim loại.
Mỗi mẫu 10 mL được cho vào lọ thủy tinh 50 mL và đậy kín.
Mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút để tạo pha hơi.
Trong quá trình đo, thời gian cân bằng là 10 giây và thời gian ghi nhận tín hiệu là 180 giây.
Khí trong không gian đầu được hút vào buồng cảm biến với lưu lượng 400 mL/phút, thời gian hồi phục của cảm biến là 170 giây.
3.7. Phân tích thống kê
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.
Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.
Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) được sử dụng và mức ý nghĩa thống kê được xác định là p < 0,05.
Tóm tắt nhanh quy trình lên men (rút lõi cho bạn)
Từ đoạn này, quy trình thực tế rất rõ:
Chọn quả cùng độ chín
Rửa sạch
Khử khuẩn nhẹ bằng chlorine dioxide (60 mg/L – 30 phút)
Rửa lại nước vô trùng
Để khô
Ủ nguyên quả (không nghiền)
Lên men tự nhiên ở nhiệt độ phòng
Thu dịch theo thời gian (7 → 63 ngày)
👉 Quan trọng:
KHÔNG dùng men chủng → lên men tự nhiên
KHÔNG thêm đường
KHÔNG nghiền → lên men nguyên quả
4. Kết luận
Nghiên cứu này cho thấy có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng phenol, polysaccharide và đặc điểm các hợp chất bay hơi của nước ép nhàu khi được sản xuất dưới các điều kiện thời gian và quy mô lên men khác nhau.
Hàm lượng flavonoid trong nước ép nhàu có xu hướng tăng dần trong suốt quá trình lên men và đạt mức cao nhất tại:
L63: 36.73 ± 2.51 mg RE/100 mL
F49: 43.28 ± 1.66 mg RE/100 mL
Tổng cộng có 73 hợp chất bay hơi được xác định trong nước ép nhàu tươi và lên men, trong đó các thành phần tạo mùi chính bao gồm:
methyl hexanoate (1.39–3.33%)
3-methyl-3-buten-1-ol (0.47–5.57%)
acid octanoic (28.88–43.75%)
acid hexanoic (12.20–36.93%)
2-heptanone (3.59–39.82%)
Trong quá trình lên men ở quy mô nhà máy, hàm lượng acid hexanoic và acid octanoic giảm từ:
34.08% và 39.69%
xuống còn:
12.20% và 33.41%
Sự giảm này làm cho mùi của nước ép nhàu trở nên ít hăng hơn.
Theo hiểu biết hiện tại, đây là báo cáo đầu tiên về sự thay đổi của các hợp chất bay hơi trong nước ép nhàu trong quá trình lên men.
Kết quả của nghiên cứu này có thể góp phần cải thiện chất lượng nước ép nhàu.